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培育基的灭菌

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● 常识要点和讲授请求

1)、懂得灭菌的道理和办法

2)、懂得培育基的灭菌

3)、把握干冷灭菌道理和影响灭菌的身分

4)、把握间歇灭菌

5)、把握持续灭菌

● 本领培育请求

颠末本章节的进修,门生能把握培育基灭菌的道理和办法及其影响灭菌的身分。

● 教案内容

因为杂菌的传染,使生物反响中的基质或产品因杂菌的耗费而丧失,形成出产本领的低落;

因为杂菌所产生的一些代谢产品,或在染菌后改动了培育液的某些理化性子,使产品 的提取和别离变得坚苦,形成收率低落或使产品的品质低落;

杂菌会大批繁衍,会改动反响介质的PH值,从而使生物反响产生很是变革;

杂菌大概会分化产品,从而使出产进程失利;

产生噬菌体传染,微生物细胞被裂解,而使出产失利,等等。

5.1 灭菌的道理和办法

灭菌是指操纵物理或化学法杀或撤除物料及设备中所有有性命物资的进程。常常操纵的灭菌办法大抵有以下几种:

1. 化学试剂灭菌法

常常操纵的化学试剂有甲醛、氯气(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷等。

2. 电磁波、射线灭菌法

电磁波、紫外线或放射性物资

3. 干热灭菌法

干热灭菌前提为在160℃下保温1h。

4. 干冷灭菌法

操纵饱和蒸汽举行灭菌的办法称为干冷灭菌法。因为蒸汽存在很强的穿透本领,并且在冷凝时会放出大批的冷凝热,很复杂使卵白质凝集而杀死各类微生物。从灭菌的后果来看,干热灭菌不如干冷灭菌无效,温度低落10℃时,灭菌速度常数仅添加2-3倍,而干冷灭菌对耐热芽孢的灭菌速度常数添加的倍数可到达8-10倍,对养分细胞则更高。同时,蒸汽的来源便当,代价昂贵,灭菌后果靠得住,是今朝最为根本的灭菌办法。个别的干冷灭菌前提为:121℃,30min。

5. 过滤除菌法

操纵过滤办法制备无菌空气。

6. 火焰灭菌法

仅合用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。

5. 2培育基的灭菌

但低温诚然能杀死培育基中的杂菌,同时也会粉碎培育基中的养分成份,乃至会产生倒霉于菌体成长的物资。是以,在工业培育进程中,除了尽大概杀死培育基中的杂菌外,还要尽大概淘汰培育基中养分成份的丧失,最常常操纵的灭菌前提是120℃,20-30min。

权衡热灭菌的目标良多,最常常操纵的是“热死工夫”,即在规则温度下杀死必定比例的微生物所必要的工夫。杀死微生物的极限温度称为致死温度,在此温度下,杀死局部微生物所必要的工夫称为致死工夫。在致死温度以下,温度越高,致死工夫就越短。一些细菌芽孢菌等微生物细胞和孢子,对热的抵当力差别,是以它们的致死温度和工夫也有差别,见表5-3和表5-4。微生物对热的抵当力常常操纵“热阻”表现。热阻是指微生物在某一特定前提(次要是温度和加热办法)下的致死工夫。绝对热阻是指微生物在某一特定前提下的致死工夫与别的一微生物在不异前提下的致死工夫的比值。表5-5列出了某些微生物的绝对热阻。

表5-5某些微生物的绝对热阻及其对一些灭菌剂的绝对抵当力(大肠杆菌比拟较)

灭菌办法大肠杆菌霉菌孢仔细菌芽孢嗜菌体或病毒

干热灭菌1 2-10 1000 1

干冷灭菌1 2-10 3×1051-5

苯酚1 1-2 1×10930

甲醛1 2-10 250 2

紫外线1 5-100 2-5 5-10

由表5-5可知,芽孢或孢子的热阻要比成持久养分细胞的热阻大很多,这是因为芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的添加有关。别的,芽孢子中卵白质含水量较养分细胞低(出格是游离水份少),也是芽孢耐热强的一个起因。图5-2和图5-3辨别为大肠杆菌养分细胞和FS7954芽孢杆菌的芽孢在差别温度下的出生情形。

5.3干冷灭菌道理和影响灭菌的身分

在发酵工业中,对培育基和发酵设备的灭菌,遍及操纵干冷灭菌法。工场里,蒸汽比力复杂得到,把持操纵前提便当,是一种复杂而又价廉、无效的灭菌办法。用干冷灭菌的办法处理培育基,其加热温度和受热工夫与来菌水平和养分成份的粉碎都有干系。养分成份的赡养将影响菌种的培育和产品的天生,以是灭菌水平和养分成份的粉碎成为灭菌任务中的次要冲突,得当把握加热温度和受热工夫是灭菌任务的关头。

5.3.1灭菌动力学

1. 微生物的出生速度

1)对数残留定律

微生物受热出生的起因,次要是因低温使微生物体内的一些紧张卵白质,如酶等,产生凝集、变性,从而招致微生物没法保存而出生。微生物受热而丧失活气,但其物理性子波动。在必定温度下,微生物的受热出生按照份子反响速度实际。在灭菌进程中,活菌数渐渐淘汰,其淘汰量随残留活菌数的淘汰而递加,即微生物的出生速度与任一刹时残存的活菌数成反比,如图5-2所示,大肠杆菌的出生曲线为线性干系,称之为对数残留定律,也即反响为一级化学反响动力学为:

-dN/dt=KN

式中,N—残存的活菌数;t—灭菌工夫(s);K—灭菌速度常数(s-1),与称反响速度常数或比出生速度常数,此常数的巨细与微生物的品种与加热温度有关;dN/dt—活菌数刹时变革速度,即出生速度。

上式颠末积分可得:Nt/N0=e-kt

t=1/KlnN0/Nt=2.303/KlgN0/Nt

式中:N0—开端灭菌(t=0)时原有活菌数;Nt=经工夫t后残存活菌数。

上式是计较灭菌的根本公式,灭菌速度常数K是断定微生物受热出生难易水平的根本根据。各类微生物在一样的温度下K值是差别的,K值愈小,则此微生物愈耐热。

即便对付统一微生物,也受微生物的生理形态、成长前提及灭菌办法等多种身分的影响,其养分细胞和芽孢的比出生速度也有极大的差别,就微生物的热阻来讲,细菌芽孢是比力耐热的,孢子的热阻要比成持久细胞大很多。比方,在121℃时,枯草杆菌FS5230的K为0.47-0.063s-1,梭状芽孢杆菌PA3679的K为0.03s-1,嗜热芽孢杆菌FS1518的K为0.013s-1,热芽孢杆菌FS617的K为0.048s-1。

从上述的微生物对数出生法则和非对数出生动力学模子方程式可知,假如要到达完整灭菌,即灭菌竣事时残留的活微生物数即是0,则灭菌所需的工夫应为无穷长,这在实际中是不大概的。是以,工程上,在举行灭菌的设计时,常以为N/N0=0.001,即在1000次灭菌中,答应有一次失利。

5.3.2灭菌的温度和工夫

微生物的受热出生属于单份子反响,其灭菌速度常数K与温度之间的干系可用阿累尼乌斯公式表现:

K=Aexp(-ΔE/RT) (5.8)

或 lnK=lnA--ΔE/RT (5.9)

式中:A---频次常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R---气体常数,8.314J/mol·K;T---绝对温度,K;ΔE---微生物出生活化能,J/mol。

是以可知,ΔE/R是微生物受热出生时对温度敏理性的怀抱,此值越大,标明微生物出生速度随温度的变革越敏感;反之,就越不敏感,是以,在灭菌操纵中,ΔE/R是一个很是紧张的参数。

当培育基被加热灭菌时,常会呈现如许的冲突,这便是,加热时,微生物诚然会被杀死,但培育基中的无效成份也会随之受到粉碎,那末有何善策能够既到达灭菌请求,同时又不粉碎或尽大概少粉碎培育基中的无效成份呢?

实际证实,在高压加热的情形下,培育基中的氨基酸和维生素极易被粉碎,如在121℃,仅20min,就有59%的赖氨酸和精氨酸及别的碱性氨基酸被粉碎,蛋氨酸和色氨酸也有相称数目被粉碎。是以,必须抉择一个既能满意灭菌必要,又能够使培育基的粉碎尽大概赡养的灭菌工艺前提。

因为灭菌时杀死微生物的活化能大于培育基成份的粉碎活化能值,是以:

即跟着温度的回升,微生物的出生速度常数添加倍数要大于培育基成份的粉碎速度的添加倍数。也便是说,当灭菌温度回升时,微生物杀死速度的进步要跨越培育基成份的粉碎速度的添加。

从上述的阐发可知,在热灭菌进程中,同时会产生微生物出生和培育基粉碎这两种进程,且这两种进程的举行速度都随温度的低落而加快,但微生物的出生速度随温度的低落更加分明。是以,可抉择符合的灭菌温度和工夫来和谐两者之间的冲突。

一个事例为,灭菌要到达杀死99.99%的细菌芽孢,有两种办法能够采纳,一种是118灭菌15min,别的一种是128灭菌5min。而培育基中B族维生素的保留值在前一种办法为90%,后一种办法为95%。是以可知,在低温下灭菌,工夫是一个很是紧张的身分,图5-6和表5-8辨别表现杀死细菌芽孢与保留B族维生素的工夫与温度干系以及在不低落规则的灭菌前提下(),灭菌温度、工夫和养分成份粉碎量的干系。

表5-8灭菌温度、工夫与养分成份粉碎量的干系()

灭菌温度灭菌工夫(分)养分成份粉碎量%

100 400 99.3

110 36 67.0

115 15 50.0

120 4 27.0

130 0.5 8.0

145 0.08 2.0

150 0.01 1.0

是以可知,若要淘汰养分成份的粉碎,可低落温度灭菌。

据此,能够在灭菌时抉择较高的温度、较短的工夫,如许便既可到达必要的灭菌水平,同时又可淘汰养分物资的丧失。

5.3.3影响灭菌的身分

1) 培育基成份

固体培育基的灭菌工夫要比液体培育基的灭菌工夫长。

2) 培育基的物理形态

培育基的PH值愈低,灭菌所需的工夫就愈短。

3) 培育基的PH值

4) 培育基中的微生物数目

是以,在实际出产中,不宜采纳紧张霉腐的质料和败北的水质,因为这类质料中岂但无效成份少,并且微生物数目中,完整灭菌比力坚苦。

5) 微生物细胞中水含量

6) 微生物细胞菌龄

年老细胞复杂被杀死。

7) 微生物的耐热性

各类微生物对热的抵当力是差别的,细菌的养分体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感,而放线菌、酵母、霉菌孢子比养分细胞的抗热性要强,细菌芽孢的抗热性就更强。个别讲,无芽孢的细菌或霉菌孢子在100以下加热3-5min都可被杀死,可是有些细菌芽孢的热阻较大,100、30min仍未被杀死,以是灭菌的完整与否应以杀死细菌孢为标准。

8) 空气解除情形

蒸汽灭菌进程中,温度的把持是颠末把持罐内的蒸汽压力来完成。压力表表现的压力应与罐内蒸汽压力绝对应,即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。可是假如罐内空气解除不完整,压力表所表现的压力就不单是罐内蒸汽压力,还包含了空气分压,是以,此时罐内的实际温度就低于压力表表现压力所对应的温度,凤致形成灭菌温度不够而灭菌不完整,如表5-12所示。

表5-12蒸汽压力与温度的干系

蒸汽压力(atm) 响应的温度(℃)空气完整驱除水平罐内实际温度(℃)

0.3 107.7 完整驱除121.6

0.7 115.5 驱除非/3 115.0

1.0 121.6 驱除此以外/2 112.0

1.3 126.6 驱除此以外/3 109.0

1.5 130.5 全未驱除100.0

9) 搅拌

10) 泡沫

5.4间歇灭菌

5.4. 1间歇灭菌

培育基的间歇灭菌便是将配制好的培育基放在发酵罐或别的装配中,通入蒸汽将培育基和所用设备一路举行加热灭菌的进程,凡是也称为实罐灭菌。

间歇灭菌进程包含升温、保温和冷却等三个阶段,图5-7为培育基间歇灭菌进程中的温度变革情形。

5.4.2间歇灭菌的计较

严酷地讲在升温阶段的后期和冷却阶段的后期,培育基的温度很高,是以存在必定的灭菌感化。

是以可知,灭菌进程中加热和保温阶段的灭菌感化是次要的,而冷却阶段的灭菌感化是次要的,个别很小,能够纰漏不计。别的,还应指出的是,该当防止太长工夫的加热阶段,因为加热工夫太长,不只会粉碎养分物资,并且也有大概惹起培育液中某些无害物资的天生,从而影响培育进程的顺遂举行。

在实际出产中,也大概碰到所供蒸汽不敷、温度不够高的情形,这时候能够得当耽误灭菌

工夫。出产上乃至无效100蒸煮而到达完整灭菌的实例。如要做固体曲而没有低温蒸汽

时,可将质料用100蒸汽蒸30min,杀死此中的养分细胞,但孢子与细菌的芽孢没有被

杀死。将蒸过的质料置于室温下过夜,未被杀死的孢子便抽芽成长,芽孢发育成养分细

胞,再蒸30min便可杀死。如斯持续频频举行2-3次,亦可到达完整灭菌的目标。

5.4.3间歇灭菌的操纵

间歇灭歇是在所用的发酵罐或别的培育装配中举行的,它是在配制罐中配好培育基后,颠末公用管道输出发酵罐等培育设备中,而后开端灭菌。在举行培育基的间歇灭菌之前,凡是先将发酵罐等培育装配的分空气过滤器举行灭菌,并且用空气将分过滤器吹干。开端灭菌时,应先放去夹套或蛇管中的冷水,开启排气管阀,颠末空气管向发酵罐内的培育基通入蒸汽举行加热,同时,也可在夹套内通蒸汽举行间接加热。当培育基温度升到

70摆布时,从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热,当温度升至120,罐压为1*105Pa(表压)时,翻开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门举行排汽,固然在保温进程中,应留神凡在培育基液面下的各类入口管道都应通入蒸汽,而在液面以上的别的各管道则应排放蒸汽,如许才干不留死角,从而保障灭菌完整。保温竣事后,顺次封闭各排汽、进汽阀门,待罐内压力低于空气压力后,向罐内通入无菌空气,在夹套或蛇管中通冷水降温,使培育基的温度降到所需的温度,举行下一步的发酵和培育。

因为培育基的间歇灭菌不必要特地的灭菌设备,投资少,对设备请求复杂,对蒸汽的请求也比力低,且灭菌后果靠得住,是以,间歇灭菌是中小型出产工场常常采纳的一种培育基灭菌办法。

5.5持续灭菌

5.5. 1培育基的持续灭菌

培育基的持续灭菌,便是将配制好的培育基在向发酵罐等培育装配输送的同时举行加热、保温和冷却而举行灭菌。图5-9为持续灭菌进程中温度的变革情形。由图能够看出,持续灭菌时,培育基可在短工夫内加热到保温温度,并且能很快地被冷却,是以可在比间歇灭菌更高的温度下举行灭菌,而因为灭菌温度很高,保温工夫就响应地能够很短,极有益于淘汰培育基中的养分物资的粉碎。

5.5. 2持续灭菌的根本流程

培育基持续灭菌的根本流程如图5-10所示。持续灭菌的根本设备个别包含(1)配料预热罐,将配制好的料液预热到60-70,以防止持续灭菌时因为料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声;(2)连消塔,连消塔的感化次要是使低温蒸汽与料液疾速打仗混和,并使料液的温度很快低落到灭菌温度(126-132);(3)坚持罐,连消塔加热的工夫很短,光靠这段工夫的灭菌是不够的,坚持罐的感化是使料液在灭菌温度下坚持5-7min,以到达灭菌的目标;(4)冷却管,从坚持罐出来的料液要颠末冷却排管举行冷却,出产上个别采纳冷水喷淋冷却,冷却到40-50后,输送到事后曾经灭菌过的罐内。

图5-11为放射加热持续灭菌流程,流程中采纳了蒸汽放射器,它使培育液与低温蒸汽间接打仗,从而在短工夫内可将培育液缓慢升温至预约的灭菌温度而后在该温度下坚持一段工夫灭菌,灭菌后的培育基颠末一膨胀阀进入真空冷却器缓慢冷却,从图中能够看出,因为该流程中培育基受热工夫短,养分物资的丧失也就不很紧张,同时该流程保障了培育基物料进步先出,防止了过热或灭菌不完整等景象。

图5-12为薄板换热器持续灭菌流程,流程中采纳了薄板换热器作为培育液的加热和冷却器,蒸汽在薄板换热器的加热段使培育液的温度低落,经坚持段保温必定工夫后,培育基在薄板换热器的冷却段举行冷却,从而使培育基的预热、加热灭菌及冷却进程可在统一设备内完成。该流程的加热和冷却工夫比放射加热持续灭菌流程要长些,但因为在培育基的预热进程同时也起到了灭菌后培育基的冷却,是以节俭了蒸汽和冷却水的用量。

培育基的持续灭菌的长处是灭菌的温度较高,灭菌工夫较短,培育基的养分成份受砉珠水平较低,从而保障了培育基的品质,同时因为持续灭菌进程不在发酵罐等设备中举行,进步了发酵罐等设备的操纵率。固然与间歇灭菌进程比拟,持续灭菌进程的不敷的地方是进程所需的设备较多,操纵较为费事,染菌机遇也响应较多。

培育基采纳持续灭菌时,加热器、坚持罐(管)和冷却器以及发酵罐等都应进步灭菌,而后才干举行培育基的持续灭菌。同时构成培育基的耐热性物资和不耐热性物资可在差别温度下分开灭菌,以淘汰物资的受热粉碎水平,也可将碳源与氮源分开灭菌,免得醛基与氨基产生反响,防止无害物资的天生。

5.6间歇灭菌与持续灭菌的比力

间歇灭菌或持续灭菌都有各自的长处和错误谬误,现比力以下。

表5-14间歇灭菌与持续灭菌的比力

 

灭菌办法

长处

错误谬误

持续灭菌

1.        灭菌温度高,可淘汰培育基中养分物资的丧失

2.        操纵前提恒定,灭菌品质波动

3.        易于完成管道化和自控操纵

4.        防止了频频的加热和冷却,进步了热的操纵率

5.        发酵设备操纵率高

1. ;       对设备的请求高,需别的设置加热、冷却装配

2.        操纵较费事

3.        染菌的机遇较多

4.       ; 不得当于含大批固体物料的灭菌

5.        对蒸汽的请求高

间歇灭菌

1.        设备请求低,不需别的设置加热、冷却装配

2.        操纵请求低,适于手动操纵

3.        得当于小批量出产范围

4.        得当于含有大批固体物资的培育基的灭菌

1.        培育基的养分物资丧失较多,灭菌后培育基的品质低落

2.        需举行频频的加热和冷却,能耗较高

3.        不得当于大范围出产进程的灭菌

4.        发酵罐的操纵率较低

 

由表可见,不管在实际上大概在实际上,与间歇灭菌进程比拟,持续灭菌的长处很是分明。是以,持续灭菌愈来愈多地被用培育基的灭菌。

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