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微生物检测基础常识汇总(二)

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微生物惯例断定技术
 

一、外形结构和培育特色察看
1、微生物的外形结构察看次要是颠末染色,在显微镜下对其外形、巨细、摆列办法、细胞结构(包含细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特色进行察看,直观地懂得细菌在外形结构上特色,按照差别微生物在外形结构上的不同达到差别、断定微生物的目标。


2、细菌细胞在固体培育基名义构成的细胞群体叫菌落(colony)。差别微生物在某种培育基中成长繁衍,所构成的菌落特色有很大差别,而统一种
的细菌在必定前提下,培育特色却有必定波动性。以此能够对差别微生物加以区别断定。是以,微生物培育特色的察看也是微生物检验辨别中的一项紧张内容。

1)细菌的培育特色包含以下内容:在固体培育基上,察看菌落巨细、外形、颜色(色素是水溶性仍是脂溶性)、光泽度、通明度、质地、隆起外形、边缘特色及迁徙性等。在液体培育中的名义成长情形(菌膜、环)浑浊度及积淀等。半固体培育基穿刺接种察看活动、分散情形。)

罕见的细菌的培育特色
1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不法则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凹陷10.垫状 11.脐状 12.边缘划一 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24. 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状。


2)霉菌酵母菌的培育特色:
大大都酵母菌没有丝状体,在固体培育基上构成的菌落和细菌的很类似,只是比细菌菌落大且厚。液体培育也和细菌类似,有平均成长、积淀或在液面构成菌膜。
霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在前提符合的培育基里,菌丝无穷伸长沿培育基名义伸张。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有差别色彩,是以菌落边缘和中心,正面和反面色彩经常差别,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培育名义构成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。


二、生理生化尝试
微生物生化反响:指用化学反响来测定微生物的代谢产品,生化反响经常操纵来辨别一些在外形和别的方面不易差别的微生物。是以微生物生化反响是微生物分类鉴定中的紧张根据之一。


微生物检验中经常操纵的生化反响有:
1、糖酵解尝试
差别微生物分化操纵糖类的本领有很大差别,或能操纵或不能操纵,能操纵者,或产气或不产气。可用唆使剂及发酵管检验。
尝试办法:以无菌操纵,用接种针或环移取纯培育物大批,接种于发酵液体培育基管,若为半固体培育基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36±1.0℃养,天天察看成果,检视培育基色彩有没有改动(产酸),小倒管中有没有气泡,微吝啬泡亦为产气阳性,若为半固体培育基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有没有微吝啬泡,偶然还可看出接种菌有没有动力,如有动力、培育物可呈弥散成长。
本尝试次要是查抄细菌对各类糖、醇和糖苷等的发酵本领,从而举行各类细菌的辨别,是以每次尝试,常需同时接种多管。个别经常操纵的唆使剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和an-drade唆使剂。


2、淀粉水解尝试
某些细菌能够产生分化淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。
尝试办法:18~24h的纯培育物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,尝试数种培育物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1℃培育24~48h,或于20℃培育5天。而后将碘试剂直接滴浸于培育名义,若为液体培育物,则加数滴碘试剂于试管中。当即检视成果,阳性反响(淀粉被分化)为琼脂。培育基呈深蓝色、菌落或培育物四周呈现无色通明环、或肉汤色彩无变革。阳性反响则无通明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系渐渐举行的进程,是以尝试成果与菌种产生淀粉酶的本领、培育时间,培育基含有淀粉量和ph等均有必定干系。培育基ph必须为中性或微酸性,以ph7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保管于冰箱,是以以临用时制备为妥。


3、v-p尝试
某些细菌在葡萄糖卵白胨水培育基中能分化葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基天生红色化合物,称vp+)反响。
尝试办法:
1)o’meara氏法:将尝试菌接种于通用培育基,于36±1℃培育48h,培育液1mlo’meara试剂(加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine40%氢氧化钠水溶液)1ml,动摇试管1~2min,静置于室温或36±1恒温箱,若4h内不呈现伊红、即断定为阳性。亦有主意在48~50水浴安排2h后断定成果者。
2)barritt氏法:将尝试菌接种于通用培育基,于36±1培育4天、培育液2.5ml先参与5°cα萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶0.2ml,动摇2~5min,阳性菌常当即呈现红色,若无红色呈现,静置于室温或36±1恒温箱,如2h内仍不浮现红色、可断定为阳性。
3)疾速法:将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反响的三糖铁琼脂斜面培育物一接种环,乳化接种于此中,参与5%α-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后安排5min,断定成果。不产酸的培育物不能操纵。
本尝试个别用于肠杆菌科各菌属的辨别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等别的细菌时,通用培育基中的磷酸盐可妨碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。


4、甲基红(methyl red)尝试
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分化葡萄糖进程中产生丙酮酸,进一步分化中,因为糖代谢的道路差别,可产生乳酸,虎魄酸、醋酸和甲酸等大批酸性产物,可以使培育基ph值降低至ph4.5以下,使甲基红唆使剂变红。
尝试办法:挑取新的待试纯培育物大批,接种于通用培育基,培育于36±130(以30较好)3~5天,从第二天起,逐日取培育液1ml,加甲基红唆使剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阳性为黄色。迄至发明阳性或至第5仍为阳性、便可断定成果。
甲基红为酸性唆使剂,ph范畴为4.4~6.0,其pk值为5.0。故在ph5.0以下,随酸度而加强黄色,在ph5.0以上,则随碱度而加强黄色,在ph5.0或高低濒临时,可能变色不够分明,此时应耽误培育工夫,反复尝试。


5、靛基质(imdole)尝试
某些细菌能分化卵白胨中的色氨酸,天生吲哚。吲哚的存在可用显色反响表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛别离,构成玫瑰吲哚,为红色化合物。
尝试办法:将待试纯培育物小量接种于尝试培育基管,于36±1培育24h时后,取约2ml培育液,参与kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量乙醚或二甲苯,动摇试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培育液名义后,再沿试管壁徐缓参与kovacs氏试剂数滴,在打仗面呈红色,即为阳性。
尝试证实靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物感化而产生阳性反响,若先用二甲苯或乙醚等举行提取,再加试剂,则只要靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,是以成果更加靠得住。


6、硝酸盐(nitrate)复原尝试
有些细菌存在复原硝酸盐的本领,可将硝酸盐复原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
尝试办法:临试前将试剂的a(磺胺酸冰醋酸溶液)和bα-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混淆、取混淆试剂约0.1ml、加于液体培育物或琼脂斜面培育物表面,当即或于10min内呈现红色即为尝试阳性,若无红色呈现则为阳性。α-萘胺举行尝试时,阳性红色减退很快、故参与后应当即断定成果。举行尝试时必须有未接种的培育基管作为阳性比较。α-萘胺存在致癌性、故操纵时应加注意。


7、明胶(gelatin)液化尝试
有些细菌存在明胶酶(亦称类卵白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,得到凝胶性子而液化。
尝试办法:挑取18~24h待试菌培育物,以较大批穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培育基。于20~22℃培育7~14天。明胶高层亦可培育于36±1℃。每天察看成果,若因培育温度高而使明胶自己液化时应不加动摇、静置冰箱中待其凝固后、再察看其能否被细菌液化,如确被液化,即为尝试阳性。平板尝试成果的察看为在培育基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性,10~20min后,菌落周围应呈现明晰带环。不然为阳性。


8、尿素酶(urease)尝试
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分化、产生2个份子的氨,使培育基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是引诱酶,因为不管底物尿素能否存在,细菌均能分化此酶。其活性最适ph7.0
尝试办法:挑取18~24h待试菌培育物大批接种于液体培育基管中,摇均,于36±1℃培育1060120min,辨别察看成果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要达到底部,留底部作变色比较。培育2424h辨别察看成果,如阳性应持续培养至4天,作终极断定,变为粉红色为阳性。


9、氧化酶(oxidase)尝试
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素c氧化,而后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化,产生色彩反响。
尝试办法:在琼脂斜面培育物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,ewing氏改良试剂呈蓝色。阳性者无色彩改动。应在数分钟内断定尝试成果。


10、硫化氢(H2S)尝试
有些细菌可分化培育基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可天生玄色积淀物。
尝试办法:在含有硫代硫酸钠等唆使剂的培育基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培育24~28h,培育基呈玄色为阳性。阳性应持续培育至6天。也可用醋酸铅纸条法:将待试菌接种于个别养分肉汤,再将醋酸铅纸条吊挂于培育基上空,以不会被溅湿为过度;用管塞压住置36±1℃培育1~6天。纸条变黑为阳性。


11、三糖铁(TSI)琼脂尝试
尝试办法:以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培育物,穿刺接种并涂布于斜面,36±1℃培育18~24h,察看成果。
本尝试可同时察看乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分化产酸可以使斜面先变黄,但因量少,天生的大批酸,因打仗空气而氧化,加上细菌操纵培育基中含氮物资,天生碱性产品,故使斜面厥后又变红,底部因为是在厌氧形态下,酸类不被氧化,以是仍坚持黄色。


12、硫化氢-靛基质-动力(sim)琼脂尝试
尝试办法:以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培育18~24h,察看成果。培育物呈现玄色为硫化氢阳性,浑浊或沿穿刺线向外成长为有动力,而后加kovacs氏试剂数滴于培育名义,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培育基未接种的下部,可作为比较。
本尝试用于肠杆菌科细菌开端生化挑选,与三糖铁琼脂等联合操纵可分明进步筛选成果。

三、血清学尝试
血清学反响是指:响应的抗原与抗体在体外必定前提下感化,可呈现肉眼可见的积淀、凝固景象。在食品微生物检验中,经常操纵血清学反响来断定别离到的细菌,以终极确认检测成果。


血清学反响的个别特色:
1)抗原体的别离存在特同性,当有独特抗原体存在时,会呈现穿插反响。
2)抗原体的别离是份子名义的别离,这种别离虽相称波动,可是可逆的。
3)抗原体的别离是按必定比例举行的,只要比例得当时,才干呈现可见反响。
4)血清学反响大要分为两个阶段举行,但其间无严酷边界。第一阶段为抗原体特同性别离阶段,反响速率很快,只要几秒至几分钟反响便可结束,但不呈现肉眼可见景象。第二阶段为抗原体反响的可见阶段,表现为凝固、积淀、补体别离反应等。反响速率慢,需几分、几十分甚至更长工夫。并且,在第二阶段反响中,电解质、ph、温度等环境身分的变革,都直接影响血清学反响的成果。
风俗大将典范的血清学反响分三种种别:凝固反响、积淀反响和补体别离反响。


1、凝固反响
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与响应抗体别离,在电解质参与下所构成的肉眼可见的凝固景象,称为凝固反响(agglutination reaction)。此中的抗原称为凝固原,抗体称为凝固素。在该反响中,因为单元体积抗体量大,做定量尝试时,应稀释抗体。
1)直接凝固反响
颗粒性抗原与响应抗体直接别离所呈现的反响,称为直接凝固反响(direct agglution reaction)
a.玻片凝固法。是一种惯例的定性尝试办法。道理是用已知抗体来检测未知抗原。经常操纵于断定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴,在玻片上混匀,数分种后若呈现肉眼可见的凝固块,即阳性反响,证实该菌是痢疾杆菌。此法疾速、烦琐,但不能举行定量测定。
b.试管凝固法。是一种定量尝试办法。多用已知抗本来检测血清中有没有响应抗体及其含量。经常操纵于帮忙诊断某些感抱病及举行风行病学查询拜访。如肥达氏反响便是诊断伤寒、付伤寒的试管凝固尝试。因为要测定抗体的含量,故将待查抄的血清用等渗盐水倍比稀释成差别浓度,而后参与等量抗原,37℃或56℃,2~4小时观察,血清最高稀释度仍有分明凝固景象的,为该抗血清的凝固效价。


2)直接凝固反响
将可溶性抗原(抗体)先吸附在一种与免疫有关的,颗粒状微球名义,而后与相应抗体(抗原)感化,在有电解质存在的前提下,便可产生凝固,称为直接凝固反响(indirect agglutination)。因为载体增大了可溶性抗原的反响面积。当载体上有大批抗原与抗体别离。就呈现肉眼可见的反响,敏理性很高。


2、积淀反响
可溶性抗原与响应抗体别离,在有过量电解质存在下,颠末必定工夫,构成肉眼可见的积淀物,称为积淀反响(precipitation)。反响中的抗原称为积淀原,抗体为积淀素。因为在单元体积内抗原量大,为了不使抗原多余,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为积淀反响的效价。
1)环状积淀反响:是一种定性尝试办法,可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中,而后沿管壁缓缓参与等量抗原,如抗原与抗体对应,则在两液界面呈现红色的积淀圆环。


2)絮状积淀反响:将已知抗原与抗体在试管(如凹玻片)内混匀,如抗原抗体对应,而又两者比例得当时,会呈现肉眼可见的絮状积淀,此为阳性反响。


3)琼脂分散尝试:操纵可溶性抗原抗体在半固体琼脂内分散,若抗原抗体对应,且两者比例符合,在其分散的某一局部就会呈现红色的积淀线。每对立原抗体可构成一条积淀线。有几对立原抗体,便可辨别构成几条积淀线。琼脂分散可分为单向分散和双向分散两种范例。单向分散是一种定量尝试。可用于免疫卵白含量的测定。而双向分散多用于定性尝试。因为办法烦琐易行,经常操纵于测定阐发和断定庞杂的抗原成分。


3、补体别离反响
补体别离反响(complement fixation reaction)是在补体参与下,以绵羊红细胞和溶血素作为唆使系统的抗原抗体反响。补体无特同性,能与任何一组抗原抗体复合物别离而惹起反响。假如补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物别离,就会出现溶血景象,假如与细菌及响应抗体复合物别离,就会呈现溶菌景象。是以,整个尝试必要有补体、待检系统(已知抗体或抗原、未知抗原或抗体)及唆使系统(绵羊细胞和溶血素)五种成分参与。
其尝试道理是补体不但独和抗原或抗体别离。假如呈现溶菌,是补体与待检系统别离的成果,阐明抗原抗体是绝对应的,假如呈现溶血,阐明抗原抗体不绝对应。此反响操纵庞杂,敏理性高,特同性强,能测出大批抗原和抗体,以是利用范畴较广。

 

信息来源:食品尝试室办事微信大众号

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